Overekspresi Gen Scrose Transporter (SUT) pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum) untuk peningkatan kandungan sukrosa

BAB 1. PENDAHULUAN
Latar Belakang

Produksi gula nasional Indonesia mengalami kemerosotan sangat tajam dalam tiga dasawarsa terakhir. Kemerosotan akibat penurunan rendemen gula ini menjadikan Indonesia yang pernah menjadi produsen gula sekaligus eksportir gula, berubah menjadi importir gula terbesar. Upaya menyelematkan kandungan gula atau sukrosa dalam batang tebu memerlukan penanganan seoptimal mungkin. Namun usaha meningkatkan mutu tanaman tebu dengan cara konvensional (persilangan antar tanaman) memerlukan waktu yang lama. Perkembangan bioteknologi memberikan alternatif lain dalam usaha peningkatan mutu tanaman yaitu dengan transformasi gen. Keberhasilan teknologi ini sangat mendorong kemajuan rekayasa genetik dalam memodifikasi materi genetik utamanya dalam memasukkan gen-gen penyandi sifat-sifat unggul dalam suatu organisme.

Penerapan teknik ini telah menghasilkan tanaman kedelai transgenik yang toleran terhadap herbisida (Marveldani et al., 2007). Transformasi gen menggunakan Agrobacterium tumefaciens berhasil dilakukan pada kalus tebu (Fitranty et al., 2003) dan pada eksplan padi yang dikaluskan (Toki et al., 2006) namun dilaporkan pada saat pengkulturan, kalus atau eksplan transforman yang diperoleh dapat mengalami perubahan gen seiring dengan proses regenerasinya. Perubahan gen ini disebut variasi somaklonal. Kandungan sukrosa pada tanaman tebu telah berhasil dilakukan dengan memasukkan gen Sucrose Phosphate Synthase (SPS) yang dilakukan Miswar et al. (2007). Selain SPS yang mampu mengkatalisis pembentukan sukrosa, dapat juga memasukkan gen Sucrose Transporter (SUT). Metode yang ditempuh adalah overekspresi gen. Dalam tanaman tebu telah diidentifikasi bahwa enzim SPS merupakan enzim kunci untuk sintesis sukrosa dan SUT adalah protein yang bertindak sebagai translokator sukrosa dari organ pembuat (source) sukrosa ke organ penyimpan (sink) sukrosa.

Dengan meningkatkan aktivitas sintesis sukrosa dan translokasi sukrosa dengan overekspresi gen SPS dan SUT diharapkan dapat diciptakan varietas tebu baru dengan produksi gula tinggi. Saat ini tebu transgenik overekspresi SPS telah didapat dan kedepan akan ditambahkan / overekspresi gen SUT (Sugiharto, 2010).
Di sini Sucrose Transporter (SUT) merupakan protein yang menentukan transport sukrosa dari daun sebagai tempat asimilasi sukrosa ke tempat jaringan yang memerlukan atau ke tempat organ penyimpanan (sink). Transformasi SUT dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 dan LBA4404 yang mengandung vektor pCAMBIA dan promotor CaMV35S. Metode ini diharapkan mampu meningkatkan kandungan sukrosa sehingga memperoleh tanaman tebu yang memiliki sifat unggul.

Rumusan Masalah
Seberapa besar pengaruh overekspresi gen Sucrose Transporter (SUT) pada tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) sehingga mampu meningkatkan kandungan sukrosa?
Jenis eksplan apakah yang paling tepat dan efesien untuk bahan tranformasi?

Tujuan
Adapun tujuan dari penelitian ini sebagai berikut:
Untuk meningkatkan kandungan sukrosa pada tebu.
Untuk mencari jenis eksplan yang tepat dan efesien untuk bahan transformasi.

Manfaat
Keberhasilan overekspresi dan transformasi gen Sucrose Transporter (SUT) pada tebu dalam penelitian ini dapat meningkatkan kandungan sukrosa pada tanaman tebu budidaya.  
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Aktifitas Sucrose Transporter (SUT)
Sukrosa transporter memiliki peran sentral, karena mengatur alokasi sukrosa baik intra maupun di tingkat tanaman secara keseluruhan. Menurut Slameto (2010) dalam disertasinya yang berjudul “Kloning dan Karakterisasi Ekspresi Gen Famili Sucrose Transporter (SUT) pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) bahwa SUT merupakan protein yang menentukan transport sukrosa dari daun sebagai tempat asimilasi sukrosa ke tempat jaringan yang memerlukan atau ke tempat organ penyimpanan (sink).
Banyak tanaman yang mengandung Sucrose Transporter (SUTs) atau juga dikenal sebagai pembawa sukrosa yaitu Sucrose Carriers (SUCs), yang mungkin memiliki fungsi yang berbeda dalam floem loading dan unloading atau translokator sukrosa ke tempat organ penyimpanan (sink).
Menurut Eckardt (2003) peneliti terdahulu telah mentransfer SUT2 ke membran plasma SE dalam tomat (LeSUT2), pisang (PmSUC3) dan Arabidopsis (AtSUC3), kentang (StSUT2), dan jagung (ZmSUT1).
Meyer et al. (2000) memberikan lebih rinci karakterisasi Arabidopsis protein, yang mereka sebut AtSUC3. Barker et al. (2000) dalam hipotesisnya menyatakan bahwa LeSUT2 dan AtSUT2/SUC3 berfungsi sebagai sensor sukrosa dalam sieve element, berdasarkan perbandingan tanaman sukrosa transporter dengan famili yang berkarakter sensor glukosa dalam ragi.

Bakteri Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium merupakan bakteri tanah anggota famili Rhizobiaceae, gram negatif berbentuk batang (Smith, E. F dan Townsend, 1907), tidak memiliki endospora dan tubuhnya dikelilingi oleh sedikit flagella (Old dan Primose, 2003). Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit pada tanaman dengan mentransfer DNA ke genom tanaman yang secara alami hanya menginfeksi tanaman dikotil (De Ia Riva et al., 1998). Namun, telah ditemukan dari beberapa penelitian terdahulu bahwa Agrobacterium efesien untuk transformasi gen pada tanaman monokotil, angiospermae maupun gymnospermae (Toki et al., 2006).
A. tumefaciens memiliki kemampuan untuk menstransfer partikular DNA (T-DNA) yang merupakan bagian dari plasmid Ti (tumor-inducing plasmid) ke dalam inti sel tanaman yang diinfeksi (Binns and Thomashaw, 1988). Kemampuan menstransfer DNA tersebut disebabkan A. tumefaciens memiliki komponen genetik penting yang terlibat dalam proses transformasi gen antara lain: kromosom gen virulen (chv), gen virulen (vir), dan T-DNA yang terdapat dalam plasmid Ti (Rahmawati, 2006). Kromosom gen virulen pada kromosom Agrobacterium dan berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Gen vir terdapat dalam plasmid Ti yang mempunyai ukuran 200-800 kbp. Plasmid Ti ini mengandung beberapa lokus gen vir antara lain Vir A, Vir C, Vir D, Vir F, Vir G, dan Vir H yang dapat menginduksi terbentuknya tumor. Gen-gen tersebut berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi T-DNA. Gen vir yang dimiliki A. tumefaciens ini peka terhadap senyawa feolik beserta senyawa lainnya seperti glukosa dan galaktosa yang dikeluarkan tumbuhan dikotil ketika terjadi luka pada permukaan bagian luar tumbuhan (Pardal, 2002).
Adanya transfer dan integrasi T-DNA ke dalam sel tumbuhan menyebabkan terbentuknya penyakit tumor (crawn gall) dan senyawa-senyawa opine. Senyawa opine yang dihasilkan dari kondensasi antara asam amino dan gula dikumpulkan dan dikeluarkan oleh sel-sel tumor, lalu dikonsumsi oleh A. tumefaciens sebagai sumber karbon dan nitrogen (De la Riva et al., 1998).
tumefaciens yang diinfeksikan ke tanaman melepaskan T-DNA yang akan merangsang tanaman untuk mensintesis protein opine. Berbagai macam opine yang dihasilkan oleh tanaman, di antarnya octopine, nopaline, succinamopine, atau LL-succinamopine (Datta and Datta, 2002). Berdasarkan jenis senyawa yang disintesis gen-gen opine, A. tumefaciens dikelompokkan menjadi beberapa strain salah satunya GV3101 dengan tipe kromosom C58 dan jenis opine yang dihasilkan adalah nopaline (Konz and Schell, 1986).
Penelitian tentang A. tumefaciens menjadi berkembang, sehingga pada tahun 1970 para peneliti berhasil mengidentifikasi plasmid dari beberapa strain A. tumefaciens dan pada tahun 1977 para peneliti berhasil mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman, tetapi masih perlu penyempurnaan untuk mendapatkan keberhasilan transformasi yang lebih baik (Datta and Datta, 2002). Perkembangan ini membuktikan bahwa plasmid Ti telah berhasil digunakan sebagai vektor untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman (Gelvin, 2003).

Transformasi Gen Menggunakan A. tumefaciens pada Tanaman Tebu
Transformasi gen menggunakan A. tumefaciens banyak digunakan pada kalus, baik untuk infeksi maupun seleksi sel transformannya (Toki et al., 2006). Eksplan transformasi berupa potongan-potongan gulungan daun muda kemudian diinokulasi pada media kalus. Keuntungan menggunakan gulungan daun muda adalah mudah mendapatkan eksplan dalam jumlah banyak dibanding tunas apikal. Satu pucuk atau satu gulungan daun muda rata-rata dipotong menjadi 9 eksplan. Kelemahan eksplan dari gulungan daun muda adalah harus melalui fase kalus untuk menjadi tunas. Beberapa peneliti melaporkan bahwa propagasi tebu melalui fase kalus menyebabkan tingkat kematian tunasnya tinggi sehingga sulit diaklimatisasi. Okviandari (2004) melaporkan bahwa planlet transforman yang berasal dari kalus tebu varietas R579 gagal ditumbuhkan menjadi tunas tebu transgenik, karena mengalami kegagalan regenerasi menjadi tunas hijau. Regenerasi eksplan transformasi pada tebu yang melalui fase kalus menghasilkan tunas albino pada varietas PS864 dan PSTG87, dan hijau muda pada varietas R579, sehingga efiisiensi transformasi rendah (Setyati, 2005).
Penggunaan A. tumefaciens dalam transformasi tanaman lebih menguntungkan dibandingkan dengan metode lain (Arencibia et al.,1998). Keunggulan penggunaan transformasi melalui A. tumefaciens mempunyai transformasi yang tinggi, dapat terintegrasi gen asing ke dalam gen inang. Manickavasagam et al. (2004) menyebutkan bahwa keunggulan dari transformasi menggunakan A. tumefaciens adalah teknis yang mudah, meminimal pembentukan kembali genom tanaman transforman, dan mempunyai jumlah copy number yang rendah.
Fitranty et al., (2003) telah berhasil melakukan teransformasi gen P5CS menggunakan Agrobacterium pada kalus tebu. Enrequez-Oberegon et al. (1998) dan Elliot et al. (1998) telah juga berhasil melakukan transformasi gen menggunakan A. tumefaciens pada kalus tebu. Walaupun demikian progeni (keturunan) yang dihasilkan masih mengalami beberapa kendala. Salah satunya disebabkan adanya perubahan genom (variasi somaklonal) saat regenerasi eksplan selama dikultur secara in vito. Adanya variasi somaklonal ini disinyalir terjadi akibat terlalu lamanya masa prekultur (perkalusan) eksplan. Untuk mengatasi hal tersebut dibutuhkan periode prekultur jaringan yang tepat untuk meminimalisir terjadinya variasi somaklonal.
Miswar et al. (2007) telah berhasil melakukan transformasi menggunakan A. tumefaciens strain GV3101 binary vector dengan plasmid pKYS yang telah disisipkan gen penyandi enzim Sucrose Phosphat Synthase (SPS) di bawah kontrol promotor CaMV35S. Begitu juga Slameto dalam disertasinya yang berjudul “Kloning dan Karakterisasi Ekspresi Gen Famili Sucrose Transporter (SUT) pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.), yang telah memperoleh cDNA SUT1 dan cDNA SUT2 dengan ukuran penuh (full length).
Keberhasilan transformasi melalui A. tumefaciens dipengaruhi oleh strain, jenis promoter, dan jenis eksplan (Utomo, 2004). Komori et al. (2007) berpendapat bahwa 30% dari 180 publikasi terbaru, menginformasikan penggunaan pCAMBIA sebagai vektor transformasi. Sedangkan untuk DNA promoter menggunakan CaMV35S, karena jumlah dan tipe promoter yang mampu mengendalikan ekspresi transgen yang tinggi pada tanaman tebu masih sedikit. Promoter konstitutif yang mampu mengendalikan ekspresi transgen sampai 10 kali tingkat ekspresi yang dicapai promoter CaMV35S pada tanaman monokotil adalah actin promoter padi dan Ubi-1 promoter jagung (Rooke et al., 2000).

Gen GUS
Gen GUS merupakan gen penanda yang mengkode sintesis enzim β-Glucoronidase. Gen GUS banyak digunakan sebagai reporter gene (gen penanda) dalam transformasi pada tanaman. Salah satu sifat gen reporter yang dikehendaki oleh para peneliti adalah ekspresinya cepat dan mudah dideteksi. Ekspresi gen Gus dapat dideteksi dengan substrat fluorogenic dan chromogenic. X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-glucoronidase) adalah substrat chromogenic yang sangat efisien untuk lokalisasi histokimia aktivitas β-glucoronidase dalam jaringan dan sel, memberikan presipitat biru (spot biru) pada tempat terdapatnya aktivitas enzima tersebut (Ogras and Gozukirmizi, 1999).
Konstruksi gen GUS mengadung sekuen gen nptII yang menyandi terbentuknya enzim neomicyne phosphotransferase, sehingga selain sebagai gen penanda, konstruksi gen GUS juga berfungsi sebagai penyeleksi (Liu et al., 2003). Aktifitas nptII akan menyebabkan eksplan tebu tahan terhadap antibiotik yang tergolong aminoglikosida seperti genecin dan kanamisin yang terdapat di dalam media seleksi. Eksplan yang berhasil ditransformasi konstruksi gen GUS ini akan menunjukkan ketahanan terhadap antibiotik tersebut ketika ditanam di dalam media seleksi (Manickavasagam, 2004).

 
Kerangka Fikir Penelitian

























Gambar 2.5.1 Diagram Alur Kegiatan Penelitian

2.6 Hipotesis
Dengan overekspresi gen Sucrose Transporter (SUT) diharapkan mampu meningkatkan kandungan sukrosa pada tebu sehingga menghasilkan produksi gula yang berkualitas tinggi.
BAB 3. METODOLOGI
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Politeknik Negeri Jember sejak bulan April-September 2010.

Alat dan Bahan
Alat
Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: erlenmayer, beaker glass, petridish, tabung reaksi, micropipet, pH meter, stirer, gelas ukur, microwave, sentrifuge, Polymerase Chain Reaction (PCR), alat kultur (scalpel, ose, gunting, pinset, bunsen,) laminar air flow, autoclave, shaker inkubator, dan desikator.
Bahan
Eksplan transformasi adalah kalus dan pangkal tunas tebu in vitro hasil dari fase kalus. Tanaman tebu berasal dari varietas PS158. Gen Sucrose Transporter (SUT) di bawah kontrol promoter Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S yang dikonstruksi pada vektor pCAMBIA dengan promotor CaMV35S. Strain A. tumefaciens yang digunakan adalah GV3101 dan LBA4404. Media kultur yang digunakan adalah media MS dengan beberapa kondisinya.
Tabel 3.1 Jenis media beserta komposisinya yang digunakan selama penelitian berlangsung.
Media Komposisi Keperluan
MS0 MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar) Media dasar
MS1
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 3 mgl-1 2,4-D, 100 ml-1 air kelapa) Induksi kalus

MS2
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,2 ppm BAP, 0,1 ppm IAA) Induksi tunas

MS3
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,2 ppm BAP, 0,1 ppm kinetin). Multiplikasi tunas
MS4
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppmBA, 0,2 ppm kinetin, 100 ppm acetosyringone) Ko-kulivasi
MS5
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppm BA,
0,2 ppm kinetin, 500 ppm cefotaxime )
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppm BA, Eliminasi
tumefaciens
MS6
0,2 ppm kinetin, 500 ppm cefotaxime, 25 ppm higromisin )
Seleksi ketahanan antibotika vektor pCAMBIA
YEP
Yeast Extract dan Peptone cair yang berisi antibiotika 50 mgl-1 kanamisin dan 100 mgl-1 rifamfisin Mengkulturkan
A. tumefaciens

Rancangan Penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian Tugas Akhir (TA) ini adalah metode uji t karena untuk membandingkan dua macam perlakuan. Adapun dua macam perlakuan tersebut adalah jenis eksplan yang digunakan untuk bahan transformasi yakni A = kalus dan B = tunas. Dengan menggunakan metode uji t dapat membandingkan dan memperoleh jenis eksplan yang tepat dan efesien untuk bahan tranformasi.
Hipotesis : H0 : Ā = B atau Ā _ B = µd
H1 : Ā ≠ B atau Ā _ B ≠ 0
Kriteria uji :
t_( hitung)= d/s_d atau t= (|Ā-B|)/S_((Ā-B))  
Pelaksanaan Penelitian
Membuat media
Membuatan media inisiasi tebu dengan medium MS1 dan media untuk menumbuhkan tunas MS2, masing-masing bervolume 1 liter.

Persiapan Eksplan Transformasi
Eksplan tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) varietas PS158 dari gulungan daun termuda yang berumur 2-2,5 bulan dari bibit kemudian disterilkan dengan alkhohol 96 % setelah itu dibakar sampai tiga kali. Selanjutnya pucuk tebu yang telah dibakar dikupas sampai didapatkan spindle leaf yang mendekati titik tumbuh. Satu pucuk dapat dipotong-potong menjadi 9 eksplan dan setiap botol ditanam 2 eksplan.
Eksplan ditanam media MS1 dalam kondisi gelap dengan suhu 260C. Proses penyimpanan dilakukan selama 4 minggu hingga memperoleh kalus dengan ciri-ciri nodular, kompak dan menunjukkan warna kekuningan dan digunakan sebagai eksplan untuk transformasi.
Sebagian kalus disubkulturkan ke dalam media MS2 untuk menghasilkan tunas dan ditanam pada kondisi gelap selama 4 minggu. Bagian basal (pangkal) tunas tanaman ini (0,5 cm) dipisahkan dan digunakan sebagai eksplan untuk transformasi.

Kultur Agrobacterium tumefaciens
Gen SUT (Sucrose Transporter) yang telah dikonstruksi pada vektor pCAMBIA (Center for the Application of Molecular Biologi to International Agriculture (CAMBIA), Canberra, Australia, ditransformasikan ke dalam sel A.tumefaciens strain GV3101 dan LBA4404 melalui heat shock pada 420C selama 90 detik.
Koloni tunggal Agrobacterium yang positif mengandung gen SUT diinokulasi ke dalam larutan starter yakni 3 ml media Yeast Extract dan Pentone (YEP) cair yang berisi antibiotika 50 mgl-1 kanamisin dan 100 mgl-1 rifamfisin, kemudian diinkubasi pada suhu 280C di dalam shaker selama 48 jam. Selanjutnya bibit A. tumefaciens diambil 1 ml dari larutan starter ditambahkan ke dalam media YEP cair 50 ml yang mengandung antibiotika 60 mgl-1 kanamisin dan 100 mgl-1 rifamfisin. Setelah itu diinkubasi dalam shaker inkubator selama + 8 jam. Sel disentrifuge pada 5.000 rpm, 40C selama 10 menit. Pellet A. tumefaciens yang terbentuk disuspensikan ke dalam media YEP cair dengan pengaturan OD600 (Optical Density) 0,6 -1,0 nm.

Transformasi Gen SUT menggunakan Agrobacterium- Mediated Transformation pada kalus dan tunas
Eksplan yang dipakai untuk transformasi adalah kalus dan pangkal tunas tebu in vitro. Jumlah kalus yang diinfeksi adalah 20 kalus, dengan masing-masing kalus memiliki massa kurang-lebih 0,2 gram kemudian dikumpulkan dan diberi perlakuan pengeringan di atas kertas saring steril di dalam laminar air fow selama 30 menit. Setelah itu ditempatkan dalam Erlemeyer yang berisi 50 ml media MS cair dan disonifkasi selama 5 menit. Infeksi Agrobacterium dilakukan dengan cara merendam kalus dalam suspensi Agrobacterium (OD600 akhir disetarakan 0,6) yang mengandung acetosyringone (100 mgl-1), yang selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 °C selama 30 menit. Sebelum ko-kultivasi, material yang telah terinfeksi dicuci satu kali dengan air steril kemudian dikeringkan dalam laminar air flow. Ko-kultivasi dilakukan dengan memindahkan kalus yang diinfeksi pada media MS1 ditambah 100 mgl-1 aceosyringone pada kondisi gelap dengan suhu 28 °C selama 3 hari.
Pangkal tunas tanaman in vitro berdiameter 3 mm dan tinggi 5 mm yang diisolasi dari tunas tebu in vitro yang tingginya lebih dari 1,5 cm disimpan di dalam media MS cair di dalam LAFC. Jumlah eksplan yang diinfeksi adalah 50 eksplan, 25 eksplan untuk uji GUS dan 25 eksplan untuk kokultivasi. Kemudian ditiriskan di atas tissue steril sambil melakukan penusukan sebanyak 4-5 kali menggunakan jarum suntik steril yang berdiameter 1 mm. Tanaman yang telah dilukai direndam dalam MS cair 50 ml yang mengandung A. tumefaciens dengan kerapatan sel bakteri (OD(600) infeksi) = 1.0, dan acetosyringone (100 mgl-1). Setelah itu diprekultur di dalam media MS yang diletakkan dalam shaker dengan kecepatan putaran 150 rpm pada suhu 28 °C selama 30 menit. Eksplan terinfeksi dikeringkan menggunakan kertas filter steril dan diinokulasi pada media MS padat yang mengandung acetosyringone. Ko-kultivasi dilakukan selama 3 hari di dalam gelap dengan suhu 28 °C.

Seleksi Transforman pada medium antibiotik
Tahapan selanjutnya adalah seleksi transforman yaitu untuk mengetahui keberhasilan transformasi dan ketahanan antibiotika dari transforman. Eksplan putatif terinfeksi dicuci tiga kali dengan 500 mgl-1 cefotaxime dan kemudian dikeringkan di atas kertas filter steril dalam laminar air fow.
Untuk kalus yang terinfeksi disubkultur pada media MS4 untuk mengeliminasi A. tumefaciens dan diinkubasi pada kondisi gelap selama satu minggu. Kemudian kultur ditransfer pada media seleksi MS5, serta diinkubasi pada kondisi yang sama selama 14 hari. Proses seleksi dilakukan sebanyak 5 siklus. Tunas yang diperoleh dari kalus tunggal ditetapkan sebagai satu klon putative transforman.
Tunas yang terinfeksi dan telah diko-kultivasi disubkultur ke dalam media MS5 pada itensitas cahaya sekitar 2000 lux selama 16 jam per hari dengan suhu 270C. Proses seleksi dilakukan sebanyak lima siklus, tiap siklus 14 hari. Setelah melalui 5 siklus, tunas yang tumbuh disubkultur ke media MS0 selama 4 minggu untuk mendukung pertumbuhan selanjutnya.

Analisis Polymerase Chain Reaction (PCR)
Analisis PCR dilakukan dengan DNA genom yang telah diisolasi menggunakan TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Bio Inc) dan satu set primer yang didesain dari sekuen DNA CaMV, nptII (the neomycin phosphotransferase gene) atau gus. Kondisi reaksi PCR yang digunakan untuk denaturasi, annealing, dan extention berturut-turut adalah pada 98°C selama 10 detik, 55°C selama 30 detik, 72°C selama 1 menit dengan 30 siklus. DNA yang teramplifikasi kemudian dianalisis dengan elektroforesis pada 1% gel agarosa dan difoto.

Uji Gen GUS
Uji gen GUS dilakukan terhadap eksplan tebu yang sudah dikokultivasi di dalam ruang gelap selama 3 hari sesuai dengan prosedur histochemical yang disebutkan oleh Jefferson et al. (1987) dengan beberapa modifikasi. Sample dicuci satu kali dengan larutan buffer 0,1 M potassium phosphate, pH 7,0. Sample diinkubasi dalam larutan buffer yang berisi 2% metanol, 0,3% Triton X-100, 0,5 mM potassium ferricyanide, 0,5 mM potassium ferrocyanide dan 0,5 mg ml–1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide pada suhu 37°C, diletakkan di dalam shaker dengan kecepatan putaran 85 rpm selama 48 jam. Sampel dicuci dengan etanol 70%. Pengamatan spot atau bercak berwarna biru karena adanya ekspresi gen GUS dilakukan menggunakan mikroskop.

















DAFTAR PUSTAKA


Arencibia, A.D., E.R Carmona., P Tellez., M. Chan., S.M. Yu., L.E. Trujillo. and P. Oramas. 1998. An Efficient Protocol for Sugarcane (Saccharum spp.L.) Transformation-mediated by Agrobacterium tumefaciens. Trans. Res. 7: 213-222.

Binns A.N. and Thomashow, M.F. 1988. Cell Biology of Aagrobacterium Infection and Transformation of Plants. Annual Review of Microbiolog. 42: 575-606.

Datta K. and S.K. Datta. 2002. Plant Transformation. In Moleculac Biology: A Partical Approach. Gilmartin, P., and C. Bowler. 2002 (Eds.) Oxpord University Press. Volume One-Chapter 2: 13-32.

De la Riva G.A., J. Gonzalez-Cabrera, R. Vazquez-Padron, and C. Ayra-Pardo,. 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. EJB Electronic Journal of Biotechnology 1 (3): 118-133.

Eckardt, Nancy. 2003. The Function of SUT2/SUC3 Sucrose Transporters: The Debate Continues. The Plant Cell Jurnal, Vol. 14: 1259-1261.

Elliot, A.R., Cambell, J. A., Brettel, R. I.S., and Cristopher, P.L 1998. Agrobacterium-mediated Transformation of Sugarcane Using GFP as a Screenble Marker. Aust J. Plant Physiol. 25:739-743.

Enriquez-Obregon, G.A., Vazquez-Padron, R.I. Pieto-Samsonov, D.L., Della Riva G.A., Selman-Housein, G. 1998. Herbicide-resistant Sugarcane (Saccharum officinarum L.) Plants by Agrobacterium-mediated Transformation. Planta. 206: 20-27.

Fitranti, N., Nurilmala, F., Santoso, J., dan Minarsih, H. 2003. Efektivitas Agrobacterium Mentransfer Gen P5CS ke dalam Kalus Tebu Klon PS 851. Menara Perkebunan 71(1): 16-27.

Gelvin S.B. 2000. Agrobacterium and Plant Genes Involved in T-DNA Transfer and Integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Moll. Biol. 51: 233-256.

Komori, Imayama, Kato, Ishida, Ueki, and Komari. 2007. Current Status Of Binari Vectors and Superbinari Vectors. Plant Physiology. 145: 1155-1160.

Koncz Cs., and Schell J. 1986. The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector. Mol Gen Genet. 204: 383-396.

Liu D., S.V. Oard, J.H. Oard. 2003. High Transgene Expression Levels In Sugarcane (Sacchanarum Officinarum L.) Driven by The Rice Ubiquitin Promoter RUBQ2. Palnt Science. 165: 743-750.

Marveldani., M. Barnawi. K. Setiawan., dan S.D. Utomo. 2007. Pengembangan Kedelai Transgenik yang Tahan Herbisida Amonium-glufosinat dengan Agrobacterium tumefaciens. Jurnal Akta Agrosia Vol. 10 No 1 hlm 49-55.

Manickavasagam, M., Ganapathi, A., Anbazhagan, V.R., Sudhakar, B., Selvaraj, N., Vasudevan, A., dan Kasthurirengan, S. 2004. Agrobacterium-mediated Genetic Transformation and Development of Herbicide-resistant Sugarcane (Saccharum species hybrids) Using Axillary Buds. Plant Cell Rep. 23: 134-143.

Miswar, Sugiharto, B., Soedarsono, J., dan Moeljapawiro, S. 2007. Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase (SoSPS1) Menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk Meningkatkan Sintesis Sukrosa pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) Berk. Penel. Hayti. 12: 137-143.

Ogras T.T., and Gozukirmizi N. 1999. Expression And Inheritance of GUS Gene in Transgenic Tobacco Plants. Tr. J. of Botany. 23: 297-302.

Okviandari. 2004. Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) dengan Bantuan Agrobacterium tumefaciens. Tesis. Program Pasca Sarjana. Universitas Jember. Jember, Indonesia. pp. 43.

Old, R.W., dan Primose, S.B. 2003. Prinsip-prisip Manipulasi Gen (Pengantar Rekayasa Genetika). Ed. IV. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Pardal J.S. 2002. Perkembangan Penelitian dan Transformasi.

Rahmawati, S. 2006. Status Perkembngan dan Perbaikan Sifat Genetik Padi Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen 2(1): 36-44.

Rooke L., Byrne D., and Salgueiro S. 2000. Marker Gene Expression Driven By The Maize Ubiquitin Promoter In Transgenic Wheat. Ann.appl. Biol. 136: 167-172.

Setyati S. 2005. Optimasi Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) dengan Bantuan Agrobacterium tumefaciens. Tesis. Program Pasca Sarjana. Universitas Jember. Jember, Indonesia. pp. 39.

Smith, E.F., dan Townsend, C.O. 1907. A. Plant-Tumor of Bacterial Origin. Science 25: 671-3.

Toki, Hara, Ono, Onodera, Tagiri, Oka, dan Tanaka. 2006. Early Infection of Scutellum Tissues with Agrobacterium allows High-speed Transformation of Rice. The Plant Jurnal 47: 969-976.

Utomo, S.D. 2004. Pengaruh Strain Agrobacterium Terhadap Efisiensi Transformasi Genetik Jagung Genotipe Hibrida Hill. Ilmu Pertanian 11 (2): 1-10.

Sastrosupadi, Adji. 2000. Rancangan Percobaan Praktis. Kanisius: Yogyakarta.
Sudjana. 2002. Metoda Statistika. Tarsito: Bandung.